1、安装，加载所用到到R包
用BiocManager安装，可同时加载依赖包
source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
BiocManager::install("clusterProfiler")
library(clusterProfiler) ##富集分析
library(topGO) ###画GO图
library(AnnotationHub) ##获取数据库
library(BiocFileCache) ##依赖包
library(dbplyr) ##依赖包
library(pathview) ##看KEGG pathway
2、利用annotataionHub去抓取目标orgDb
ah <- AnnotationHub() ##收索所有orgdb，到ah
unique(ah$dataprovider) ##可查看数据注释来源
query(ah, "Apis cerana") ##查找目标物种
tar_org <- ah[["AH62635"]] ##下载目标物种到org数据
3、了解org数据库
主要有5个函数
columns(x)： 显示当前对象有哪些数据
keytypes(x)： 有哪些keytypes可以用作select或keys的keytypes参数
keys(x, keytype, ...)：返回当前数据对象的keys
select(x, keys, columns, keytype, ...)：基于keys, columns和keytype以data.frame数据类型返回数据，可以是一对多的关系
mapIds(x, keys, column, keytype, ..., multiVals)： 类似于select，只不过就返回一个列。3.1 以symbol形式展示
head(keys(tar_org,keytype = "SYMBOL"),30) ##默认为ENTREZID
3.2、可以查看gene类型
keytypes(tar_org)
[1] "ARACYC" "ARACYCENZYME" "ENTREZID" "ENZYME" "EVIDENCE" "EVIDENCEALL" "GENENAME"
[8] "GO" "GOALL" "ONTOLOGY" "ONTOLOGYALL" "PATH" "PMID" "REFSEQ"
[15] "SYMBOL" "TAIR" 3.3、select则是根据你提供的key值去查找注释数据库，返回你需要的columns信息
> select(tar_org, keys= "AGO1", columns=c("TAIR","GO"),keytype = "SYMBOL")
'select()' returned 1:many mapping between keys and columns
SYMBOL TAIR GO EVIDENCE ONTOLOGY
1 AGO1 AT1G48410 GO:0004521 IDA MF
2 AGO1 AT1G48410 GO:0005515 IPI MF
3 AGO1 AT1G48410 GO:0005634 IDA CC
4 AGO1 AT1G48410 GO:0005737 IDA CC
5 AGO1 AT1G48410 GO:0005737 ISM CC
6 AGO1 AT1G48410 GO:0005737 TAS CC
7 AGO1 AT1G48410 GO:0005829 IDA CC
8 AGO1 AT1G48410 GO:0006306 RCA BP
9 AGO1 AT1G48410 GO:0006342 RCA BP
10 AGO1 AT1G48410 GO:0006346 RCA BP️找到差异基因后，必须得确定你得基因号是对应ENTREZID 或者SYMBOL，，是属于哪种类型，若没有符合上述类型，可自行找到NCBI上得数据名称，进行blast更换名字。
4、进行作图
统一将差异基因名字改为ENTREZID，防止在做GO分析的时候出现报错，需要将symbolID转换成ENTREZID：用mapIds函数就可以转换ID。
DEG.entrez_id = mapIds(x = tar_org, #### 数据库
keys = DEG.gene_symbol, #####差异基因名字
keytype = "SYMBOL", ####差异基因类型是SYMBOL
column = "ENTREZID") #####转换为ENTREZID
这时就已经把symbolID转换成ENTREZID了，但会出现个别的转换不成功的情况，就是图中NA的地方，我们进行以下操作即可去掉：
DEG.entrez_id = na.omit(DEG.entrez_id)4.1、GO分析代码
BP（Biological process）层面上的富集分析：
erich.go.BP = enrichGO(gene = DEG.entrez_id, ###差异基因ID
OrgDb = tar_org, ###数据库
keyType = "ENTREZID", ##基因ID类型
ont = "BP", ##对BP进行GO分析
pvalueCutoff = 0.5, ###fisher检验对p值
qvalueCutoff = 0.5) ###对p值进行校对对q值，一般大于p值
作图：
dotplot(erich.go.BP)解读BP层面富集分析图：
横坐标是GeneRatio，意思是说输入进去的基因，它每个term（纵坐标）站整体基因的百分之多少。圆圈的大小代表基因的多少，图中给出了最大的圆圈代表60个基因，圆圈的颜色代表P-value，也就是说P-value越小gene count圈越大，这事就越可信。也可以画柱形图
barplot(erich.go.CC)一般GO分析画这两个图就可以了，有时也把GO分析画成树形图，可以更加帮助我们理解。
plotGOgraph(erich.go.BP)树状图很大，所以我们用代码把它存成pdf，学习下如何用代码
pdf(file="./enrich.go.bp.tree.pdf",width = 10,height = 15)
plotGOgraph(erich.go.BP)
dev.off()
至此，GO分析就做完了 ----> over
4.2、KEGG pathway 介绍
KEGG pathway是最常用的功能注释数据库之一，可以利用KEGG 的API获取一个物种所有基因对应的pathway注释，human对应的API 链接如下
http://rest.kegg.jp/link/hsa/pathway 人类
http://rest.kegg.jp/link/soe/pathway 菠菜
path:hsa00010 hsa:10327
path:hsa00010 hsa:124
path:hsa00010 hsa:125
第一列为pathway编号，第二列为基因编号。这里只提供了pathway编号，我们还需要pathway对应的描述信息，同样也可以通过以下API链接得到
http://rest.kegg.jp/list/
通过该链接可以获得如下内容
path:map00010 Glycolysis / Gluconeogenesis
path:map00020 Citrate cycle (TCA cycle)
path:map00030 Pentose phosphate pathway
path:map00040 Pentose and glucuronate interconversions
path:map00051 Fructose and mannose metabolism
第一列为pathway编号，第二列为具体的描述信息。需要注意的是，pathway是一个跨物种的概念，原始的pathway编号为map或者ko加数字，对于特定物种，改成物种对应的三字母缩写, 比如human对应hsa, 所有拥有pathway信息的物种和对应的三字母缩写见如下链接
https://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html
clusterProfiler也是通过KEGG API去获取物种对应的pathway注释，对于已有pathway注释的物种，我们只需要知道对应的三字母缩写， clusterProfiler就会联网自动获取该物种的pathway注释信息。
和GO富集分析类似，对于KEGG的富集分析也包含以下两种
过表征分析 (over representation analysis, ORA) ###先会筛选，并挑选出我们感兴趣对基因
基因富集分析 (gene set enrichment analysis, GSEA) ###不进行筛选
enrich.KEGG.BP <- enrichKEGG(gene = test_sample, #### 差异基因ID ENTREZID
keyType = "kegg", ####key类型
organism = "soe", ###物种3字母
pvalueCutoff = 0.05,
pAdjustMethod = "BH",
qvalueCutoff = 0.1,)
4.2.1、柱状图
barplot(enrich.KEGG.BP, showCategory = 10)
横轴为该pathway的差异基因个数，纵轴为富集到的pathway的描述信息， showCategory指定展示的pathway的个数，默认展示显著富集的top10个，即p.adjust最小的10个。注意的颜色对应p.adjust值，从小到大，对应蓝色到红色。
4.2.2、点图
dotplot(enrich.KEGG.BP, showCategory = 10)
横轴为GeneRatio, 代表该pathway下的差异基因个数占差异基因总数的比例，纵轴为富集到的pathway的描述信息， showCategory指定展示的pathway的个数，默认展示显著富集的top10个，即p.adjust最小的10个。图中点的颜色对应p.adjust的值，从小到大，对应蓝色到红色，大小对应该GO terms下的差异基因个数，个数越多，点越大。
4.2.3、Gene-Concept Network
前面的 两款神器 两个函数，都只能展示富集最显著的 GO term，而函数 cnetplot() 可以将基因与生物学概念 (e.g.* GO terms or KEGG pathways) 的关系绘制成网状图。对于基因和富集的pathways之间的对应关系进行展示，如果一个基因位于一个pathway下，则将该基因与pathway连线，用法如下
cnetplot(enrich.KEGG.BP, showCategory = 5)
图中灰色的点代表基因，黄色的点代表富集到的pathways, 默认画top5富集到的pathwayss, pathways节点的大小对应富集到的基因个数。数字就是基因ID，如果需要更换，可以更换keytype，或者直接在enrich.KEGG.BP 的结果中进行相同ID更换
cnetplot(enrich.KEGG.BP,circular=T, ###画为圈图 colorEdge=T) ##线条用颜色区分
4.2.4、Enrichment Map
Enrichment Map 可以将富集条目和重叠的基因集整合为一个网络图，相互重叠的基因集则趋向于成簇，从而易于分辨功能模型。对于富集到的pathways之间的基因重叠关系进行展示，如果两个pathway的差异基因存在重叠，说明这两个节点存在overlap关系，在图中用线条连接起来，用法如下
emapplot(enrich.KEGG.BP)
每个节点是一个富集到的pathway, 默认画top30个富集到的pathways, 节点大小对应该pathway下富集到的差异基因个数，节点的颜色对应p.adjust的值，从小到大，对应蓝色到红色。
4.2.5 browseKEGG
browseKEGG(enrich.KEGG.BP,"soe00564") ###画出某一特定pathway的图
关于KEGG解释，可以查看链接
https://www.jianshu.com/p/f90ed1c52079
4.2.6 pathview 包里的 上帝视角 PATHVIEW!
pathview(gene.data = test_sample, ##是需要提供的基因向量，默认是Entrez_ID。其由gene.idtype决定
pathway.id = "soe00564", ###指的是在KEGG中的ID
species = "soe",
kegg.native = TRUE,###默认是TRUE输出完整pathway的png格式文件，反之输出仅是输入的基因列表的pdf文件。
)
感觉结果和 browseKEGG 差不多
持续整理。。。
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参考：https://www.jianshu.com/p/ae94178918bc GO
https://www.jianshu.com/p/47b5ea646932?utm_source=desktop&utm_medium=timeline GO
https://www.cnblogs.com/djx571/p/10271874.html GO
https://blog.csdn.net/weixin_43569478/article/details/83744384 KEGG
https://www.jianshu.com/p/f90ed1c52079 KEGG
https://www.jianshu.com/p/e133ab3169fa KEGG
